在組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)和原代細(xì)胞培養(yǎng)中的組織細(xì)胞分散(將組織塊制備成單個(gè)細(xì)胞懸液)和傳代細(xì)胞培 養(yǎng)中,貼壁生長細(xì)胞的消化分散均要使用組織細(xì)胞消化液.胰蛋白酶消化液一共有三種,分為胰蛋白酶- EDTA消化液(不含酚紅);胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚紅);胰蛋白酶消化液(不含酚紅),可根據(jù)客戶的需要 來選擇.
其中,胰蛋白酶含量為0.25%(2.5g/L),EDTA含量為0.02%(0.2g/L).PBS為常用的不含鈣鎂的細(xì)胞培養(yǎng)用 PBS.經(jīng)無菌過濾,可直接使用.
胰蛋白酶消化液對細(xì)胞的分離效果與細(xì)胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān).一般來說濃度大、溫度高( 勿高于37℃)、作用時(shí)間長,則對細(xì)胞分離能力大.但超過一定程度會損傷細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞傳代后不能貼壁 或死亡.胰酶在pH 8.0、37℃時(shí)消化能力強(qiáng).溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會降低胰酶活力,所以配制胰酶 時(shí)須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液.當(dāng)消化結(jié)束時(shí),可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用.
細(xì)胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%.用于原代細(xì)胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%.
貼壁細(xì)胞:
在培養(yǎng)瓶中長成致密單層后,繼續(xù)生長的空間不足,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多,同時(shí)代謝廢物也有較 多堆積,需要分瓶培養(yǎng),擴(kuò)增、傳代.對于懸浮生長細(xì)胞和貼壁不太緊的細(xì)胞如SP2/0,293等,可直接吹散后 分瓶;而對于貼壁較緊的細(xì)胞如Hela,HepG2,CHO等,則需要以細(xì)胞消化液消化后,才能脫落和分散,擴(kuò)瓶.一 般操作過程為(以下操作均必須嚴(yán)格按無菌操作的要求進(jìn)行):
將長成致密單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶中原來的培養(yǎng)液棄去;
加入胰蛋白酶-EDTA溶液,視細(xì)胞瓶的大小加入體積為2ml或更多(依培養(yǎng)器皿的大小而定),以使充分浸 潤;
一般消化時(shí)間約為13分鐘,肉眼觀察瓶底由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明、點(diǎn)狀(出現(xiàn)細(xì)小空 隙)時(shí),棄去細(xì)胞消化液,并加入適量的*培養(yǎng)液終止消化,吹打分散;
視實(shí)驗(yàn)?zāi)康?分入多瓶繼續(xù)培養(yǎng),一般比例為一傳二到一傳四;或接種與微孔板中.
胰蛋白酶消化液組織的消化:不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大,通常以消化后可以充分打散組織為宜.
